انتقال ژن با کمک حاملهای رترو ویروسی (DNA transfer using retroviral vectors )
رترو ویروسها دارای ژنوم RNA هستند که این توالی RNA ، در سلولهای آلوده بوسیله آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (Reverse transcriptase enzyme ) خود ویروس، به DNA تبدیل می شود . نسخه DNA تولید شده از روی RNA ویروس ، شبه ویروس یا پروویروس (Provirus ) نامیده می شود . پس از تولید ، این پروویروسها با DNA سلول ادغام می گردد. این ادغام فقط در برخی موارد به صورت اتفاقی صورت می گیرد . با اینکه فقط یک نسخه از ساختار ژنی مورد نظر را می توان در ویروس اولیه قرار داد ، با این حال از ناقلهای رتروویروسی می توان به عنوان ناقل برای انتقال ژن مورد نظر به سلول جنسی میزبان استفاده نمود.باید توجه داشت که سلولهای جنسی، غالباً از حمله رتروویروسها در امان هستند و لایه شفاف جنین مانع از دسترسی ویروس به سلولهای جنین می شود و برای انتقال ژن از این طریق حتماً باید قبلاً این لایه ، از رویان جدا شده باشد . در این روش از رویانهای 16-4 سلولی می توان استفاده نمود و برای تکمیل این جریان لازم است که سلول میزبان مرحله S چرخه تناسلی را طی کند . برای اینکه از رترو ویروس برای انتقال ژن استفاده کنیم لازم است بخش اعظمی از ژنهای ویروس را حذف کرده ، یک نسخه از RNA را که از روی DNA ساختار ژنی مورد نظر نسخه برداری شده است را در ژنوم ویروس الحاق کنیم .
در سال 1974 برای اولین بار نشان داده شد که ، بعد از تزریق ژنوم ویروس SV40 در داخل بلاستوسل ( Blastocoel ) بلاستوسیستهای موش ، وجود DNA این ویروس در سلولهای موشهای بالغ حاصل از این جنین ها ، به اثبات رسید . در این آزمایش از DNA ، MMP (Mo-Mulv-Provirus ) استفاده شد که این DNA در ژنوم سلولها تثبیت شده و به نسل بعد منتقل گردید و از این طریق جمعیتهای مقاوم ایجاد گردید . (Jaenisch, 1976; Stuhlmann, Jähner and Jaenisch, 1981 ) برای استفاده از این پیش ویروس به عنوان حامل ، قسمتهای مختلف ژنوم ویروس همراه با توالی ژنی که باید انتقال یابد در غالب یک ساختار ژنی یکپارچه و قابل انتقال مجدداً جایگزین می شود . باید دقت شود LTR ( دو توالی چند صد بازی که در هر دو انتهای بعضی از مولکولهای DNA بویژه DNA ژنومی رترو ویروسها یافت شده است و این توالی در هر یک از دو انتها مشابه هم هستند منتهي در بعضی موارد معکوس یکدیگرند) و منطقه psi سالم و دست نخورده باقی بماند . پوشش ویروس بوسیله یک پرو ویروس ثانویه ایجاد می شود که علائم پوششی را از دست داده است . (Mann, Mulligan and Baltimore, 1983; Cone and Mulligan, 1984 )
ژنوم نو ترکیب حاصل از ترکیب ژن مورد نظر و ژنوم رترو ویروس داخل پوشش پروویروس قرار می گیرند و برای انجام عمل انتقال ، سلولهای هدف بوسیله این رتروویروسهای نوترکیب آلوده می شوند . ژنوم رتروویروس به سلول تزریق شده و وارد هسته شده در برخی موارد با ژنوم اصلی سلول ادغام می شود . جنین های حاصل از این سلول های آلوده به ژنوم نوترکیب ، در داخل رحم حیوانات ماده قرار می گیرند . ژنوم حیوانات تولید شده از این جنینها ، بعد از تولد ، باید برای اثبات وجود ساختار ژنی مورد نظر مورد آزمایش قرار گیرد .
Putten و همکارانش ( 1985 ) ازطریق آلوده کردن جنینهای بدون زونا پلوسیدای موش با رترو ویروسهای ناقص نوترکیب شده ، موفق به تولید موشهای انتقال ژنی حامل یک ژن دی هیدروفولیک رودکتاز جهش یافته شدند . Rubenstein, Nicolas and Jacob ( 1986 ) توانستند ورود پرو ویروس را هنگامی که جنینهای فاقد پوشش بطور مشترک با سلولهای Psi2 کشت شدند را به اثبات برسانند . در آزمایشی از طریق آلوده کردن جنینهای قبل از کاشت داخل رحم ، بوسیله رترو ویروسهای نوترکیب با ژن کامل بتا گلوبین انسانی ( b - globin )همراه با آغازگر ( promoter ) آن ، موشهای تولید شده ، ژن انتقال یافته را در سیستم هموپوئتیک ( Hemopoetic system ) خود نشان دادند. میزان موفقیت در انتقال ژن به کمک رتروویروسها بسیار بالا است ولی دارای معایبی نیز می باشد که عبارتند از :
1. تعداد کم نسخه های الحاق شده
2. نیاز به مراحل بیشتر برای تولید رتروویروسها
3. محدودیت برای اندازه DNA بیگانه تزریقی ، معمولاً 15-9 هزار باز (kb )
4. توانایی تولید بالقوه نوترکیبی ژنتیکی نامطلوب که می تواند در کار رتروویروس اختلال ایجاد کند .
5. نسبت بالای تولید حیوانات موزائیک
6. احتمال بروز اختلال در بیان شدن ژن انتقالی بوسیله ترتیبهای رتروویروسی الحاق شده
|
حالت خطی
